Peptydy, peptydy, wszędzie peptydy i coraz to więcej „znawców” peptydów. Gdzie się nie obejrzysz, tam ktoś sprzedaje peptydy, gdzie się nie odwrócisz, tam kolejna reklama wykładu lub webinaru o peptydach. Z jednej strony to dobrze, bo w peptydach tkwi ogromny potencjał. Z drugiej strony źle, bo bardzo łatwo jest spartaczyć coś dobrego. I właśnie o tym ten artykuł, czyli jak sprzedawcy nie wiedzą, co sprzedają i jak „znawcy” nie wiedzą, o czym mówią.

A swoją drogą, czy kiedykolwiek zastanawiało was określenie „not for human use” lub „for research use only”? Być może to nie jest tylko pusty zwrot nadany w celach formalnoprawnych, a ma bardziej wyrafinowaną przyczynę. Sprawdźmy więc.

Za kurtyną

Zapoznanie się z profilem działania danego środka nie wymaga od nas specjalnego wysiłku. Wklepujemy frazę w wyszukiwarkę lub pytamy kogoś mądrzejszego i wiemy, że peptyd X wykazuje działanie Y. Podejmujemy decyzję o włączeniu środka do cyklu lub terapii. Kupujemy peptyd, wykonujemy iniekcję i czekamy na rezultaty. Koniec filozofii.

Nie zawsze jednak możemy się rzeczonych rezultatów doczekać, ponieważ większość peptydów na rynku sprowadzana jest od chińskich lub indyjskich handlarzy (pośredników), a handlarze bardzo często kierują się zasadą, że „im taniej, tym lepiej”. Ponadto, związki chemiczne pochodzące z tych państw bardzo często pozostawiają wiele do życzenia w kontekście jakości. Deklaracje wytwórców nagminnie mijają się z prawdą, a fałszowanie dokumentacji, w celu pozytywnego przejścia odgórnie zapowiedzianej kontroli danej placówki, jest w tych krajach normą. Szerzej o skali tego rodzaju oszustw traktuje książka Bottle of Lies: The Inside Story of the Generic Drug Boom.

Wracając do sedna, peptydy to towar „z podziemia”, niezależnie od tego czy producent ma w nazwie ‘pharma’, ‘laboratories’, ‘sciences’ czy cokolwiek innego i niezależnie w jakim państwie prowadzi swoją „działalność”. A to znaczy, że tak zwany ‘producent’ (czytaj: taki, który oficjalnie nigdy nie zarejestrował swojej ‘produkcji’ czy też swoich ‘produktów’) sprowadzał peptydy z Chin na własną rękę, zwykle nie mając żadnej fundamentalnej wiedzy z dziedziny farmacji lub farmakologii. Ponadto, tylko nieliczni producenci sprowadzają surowce bezpośrednio od wytwórcy. Pozostali (czyli większość) korzysta z usług pośrednika.

Chiny to prawdziwe imperium wytwórcze i produkcyjne. Praktycznie każdy przedmiot, urządzenie, lek czy suplement ma w sobie coś z Chin. Nie inaczej jest w przypadku surowców farmaceutycznych. Praktycznie każda firma farmaceutyczna sprowadza surowiec z Dalekiego Wschodu. Nieważne czy to Bayer, Merck, Pfizer, czy jeszcze ktoś inny. To jest często argument, który wykorzystują nasi handlowcy. Tyle że między podziemiem, a farmacją istnieje ogromna różnica w kolejnych procesach produkcyjnych.

Surowiec, który przychodzi do firmy farmaceutycznej, przechodzi przez liczne badania, które m.in. potwierdzają obecność i właściwość substancji czynnej, w tym jej ilość i formę, obecność zanieczyszczeń mikrobiologicznych i chemicznych oraz właściwości fizykochemiczne. Niekiedy kolejnym etapem jest także zmiana lub nadanie odpowiedniej formy substancji czynnej oraz zestawienie jej w otoczeniu innych substancji mających wpływ na właściwości gotowego produktu lub poddanie jej kolejnym, niezbędnym reakcjom. To jest to, co różni zawodowców od handlowców.

Farmakologia i… kapryśne peptydy

Związki o budowie peptydowej są z natury dość kapryśne, a proces ich syntezy bywa żmudny i złożony. W dodatku przechowywanie oraz transport peptydów bywa niekiedy problematyczny, bowiem, nawet w formie liofilizowanej (tj. „sproszkowanej” i pozbawionej wody) muszą być one przechowywane w odpowiedniej temperaturze.

W przypadku „klasycznych” środków dopingujących, które nie są peptydami, zwracamy dużą uwagę na to, w jakiej postaci będą przyjmowane. Przykładem mogą być estry testosteronu. Farmakokinetyka propionianu jest odmienna od tej, którą wykazuje cypionat. Wiemy, również że niektórzy mogą źle reagować na daną formę testosteronu. Nie jest to wiedza tajemna. Mało kto bierze pod uwagę jednak to, że w przypadku związków o budowie peptydowej sprawa wygląda dość podobnie.

W bardzo dużym uproszczeniu, peptydy są związkami zbudowanymi z aminokwasów. Pomiędzy grupą aminową (-NH2) jednego aminokwasu, a grupą karboksylową (-COOH) drugiego aminokwasu, może dojść do wytworzenia wiązania. Takie wiązanie nazywane jest wiązaniem peptydowym [1]. Kluczową kwestią w przypadku peptydów jest odpowiednia sekwencja (kolejność) aminokwasów w łańcuchu. Za przykład może posłużyć nam stosunkowo popularny i prosty związek, jakim jest glutation. Glutation składa się z trzech aminokwasów: glutaminy (Glu), cysteiny (Cys) oraz glicyny (Gly) [2]. Zmiana kolejności którejkolwiek ze składowych będzie skutkowała utratą funkcji biologicznej, która jest charakterystyczna dla glutationu.

Synteza peptydów – co może pójść nie tak?

W zależności od tego, jaki peptyd chcemy uzyskać, możemy posłużyć się różnymi metodami. Synteza dłuższych peptydów, takich jak insulina, glukagon czy kalcytonina, prowadzona jest zazwyczaj przy udziale zmodyfikowanych bakterii (np. E. coli). Krótsze peptydy, takie jak wspomniany wcześniej glutation, mogą być uzyskiwane w wyniku syntez enzymatycznych [3]. Złotym standardem w produkcji peptydów o liczbie aminokwasów 5-50 pozostaje jednak „prosta” synteza chemiczna. Początkowo tego typu syntezy prowadzono w roztworach, jednak z biegiem czasu na popularności i znaczeniu zyskała metoda SPPS (ang. solid-phase peptide synthesis) [4][5].

Co może popsuć się podczas syntezy peptydu?

  • „Wypadanie” niektórych aminokwasów (pojedynczego lub kilku) [6]
  • Przyłączenie dodatkowych aminokwasów [7]
  • Niekompletne usunięcie grup zabezpieczających [8][9]
  • Utlenianie oraz redukcja niektórych aminokwasów [10]
  • Racemizacja [11]
  • Dimeryzacja [12]

Załóżmy jednak, że w przypadku syntezy naszego peptydu wszystko przebiegło zgodnie z planem: nasz peptyd ma pożądaną sekwencję, aminokwasy się nie utleniły/zredukowały, nie racemizowały, nie doszło do powstania agregatów. Sam surowiec jest pozbawiony zanieczyszczeń chemicznych, fizycznych czy mikrobiologicznych. Mamy teoretycznie to, czego chcieliśmy.

W jednym z ostatnich etapów SPPS oraz podczas „doczyszczania” peptydu używa się kwasu trifluorooctowego (TFA; ang. trifluoroacetic acid), wobec czego możemy spodziewać się jego obecności w gotowym produkcie [13]. Zazwyczaj właśnie w takiej postaci (soli trifluorooctanowej) nasz peptyd ładowany jest do fiolek czy innych opakowań, a Ty go potem kupujesz od swojego handlarza z napisem „not for human use”, tyle że nieszczególnie wziąłeś to oświadczenie sobie do serca.

Kwas trifluorooctowy (TFA) – co w nim złego?

Czy spotkałeś się kiedykolwiek z tym, że jakiś lek lub inny preparat przeznaczony dla ludzi zawiera w składzie TFA? A może znajdziesz choć jedno badanie kliniczne, w którym podawano ludziom peptydy w takiej formie? No cóż…

Zacząć wypadałoby od tego, iż TFA, w odróżnieniu od np. kwasu solnego (HCl), jest związkiem niekompatybilnym biologicznie. W praktyce oznacza to tyle, że nasz organizm nie bardzo wie, jak ma się wobec niego zachować. W żadnym ze szlaków metabolicznych nie dochodzi do wytworzenia TFA. Z drugiej strony, HCl jest dużo silniejszym kwasem od TFA, a mimo tego, to on jest obecny w licznych formulacjach leków (nawet iniekcyjnych) w bardzo małych stężeniach. Na próżno więc szukać TFA w preparatach, które przeznaczone są dla ludzi.

W badaniach wykazano, że związki TFA prowadzą do zmniejszenia liczebności komórek (zahamowanie proliferacji) już w bardzo niewielkich stężeniach (10-9-10-7 M). Porównywano je z analogicznymi związkami w formie chlorowodorku [14]. Warto dodać, że nawet wyższe stężenia chlorowodorku nie były w stanie doprowadzić do efektu biologicznego, który wywierał TFA [14].

TFA jest produktem metabolicznego rozkładu lotnego środka znieczulającego – halotanu. Uważa się, że to właśnie TFA jest odpowiedzialny za zapalenie wątroby wywołane przez ten lek, poprzez powodowanie niekorzystnych zmian w strukturach białkowych, polegających na ich trifluooroacetylacji. Acetylacja tego typu wiązana jest z halotanowym zapaleniem wątroby [15] oraz z silną neurotoksycznością [16].

Kwas trifluorooctowy jest związkiem chaotropowym. Wykazano, że aniony chaotropowe są w stanie upośledzać funkcjonowanie błon komórkowych, negatywnie wpływać na procesy katalizy enzymatycznej, degradować drugorzędową strukturę białek oraz prowadzić do ich destabilizacji [17].

Wobec powyższych informacji, podawanie peptydów z ponadprogramowym i zupełnie niepotrzebnym TFA nie wydaje się być najlepszym pomysłem, ale trzeba też wyraźnie podkreślić, iż stężenie TFA w solach peptydowych jest niewielkie. Z tego też powodu, nie chcemy was zniechęcać do stosowania peptydów, w których tkwi ogromny potencjał i dlatego na dzień dzisiejszy nasze stanowisko w tej sprawie jest neutralne. Mamy jednak nadzieję, że ujawnienie tych informacji „sprowokuje” popyt na bezpieczne formy peptydów.

No dobra chłopaku, ale powiedz Ty nam lepiej, co możemy zrobić z peptydami w celu uniknięcia TFA?

Modyfikacje peptydów

Ponownie wyobraźmy sobie sytuację, w której mamy do czynienia z peptydem wzorcowym. Poddanie związku peptydowego odpowiednim modyfikacjom może sprawić, że dany środek będzie zdatny do użytku nie tylko w formie iniekcyjnej, ale też w formie doustnej, podjęzykowej czy donosowej.

Doskonałym przykładem takiego związku jest BPC-157. Początkowo, peptyd ten był dostępny tylko i wyłącznie w formie iniekcyjnej, jednakże okazało się, że możliwe jest przeprowadzenie go w stabilną sól argininową, którą można przyjmować doustnie [18]. Proces stabilizowania peptydów przy pomocy aminokwasów zasadowych, który ma zwiększyć ich odporność na kwasową proteolizę i umożliwić podanie per os, zastosowano również w przypadku AOD-9401 (lipolityczny fragmenty hGH 176-191) [19]. Oprócz bezpośredniego modyfikowania związków peptydowych, istnieje możliwość dostosowania formulacji w taki sposób, aby nadawała się do podania konkretną drogą. Przykładem takiego związku jest epitalon, zazwyczaj stosowany w postaci iniekcji, który może być przyjmowany również na śluzówkę nosa oraz podjęzykowo [20].

Aktualnie prowadzi się wiele badań nad związkami peptydowymi, które mają na celu wykluczenie konieczności „kłucia się”. Powyższe zagadnienie szerzej opiszę w artykule dotyczącym alternatywnych dróg podania związków peptydowych, który ujawnimy już niebawem.
Do następnego.

Opracowali:

Patryk Kowalski – pasjonat, twórca i redaktor sarmpedia.pl, redaktor hqpeptides.com i sterydiany.pl
Donat Janeta – magister farmacji i pasjonat, prelegent wielu konferencji naukowych

Serdeczne podziękowania dla Michała Domańskiego, który naprowadził mnie na ten temat i wyjaśnił wiele wątpliwości oraz za to, że zawsze służy mi radą i swoją ogromną wiedzą, która nigdy nie ma końca (bynajmniej ja go nie dostrzegam).

Najlepszej jakości peptydy znajdziesz tutaj:
www.hqpeptides.com

Literatura:

1. Rode, B. M. (1999). Peptides and the origin of life1. Peptides, 20(6), 773–786.
2. Gaucher, C., Boudier, A., Bonetti, J., Clarot, I., Leroy, P., & Parent, M. (2018). Glutathione: Antioxidant Properties Dedicated to Nanotechnologies. Antioxidants, 7(5), 62.
3. Mathieu Verbeken, S. V. D. (2012). Purity profiling of Peptide Drugs. Journal of Bioanalysis & Biomedicine, s6.
4. Guzman, F., Barberis, S., & Illanes, A. (2007). Peptide synthesis: chemical or enzymatic. Electronic Journal of Biotechnology, 10(2), 0–0.
5. Merrifield, R. B. (1963). Solid Phase Peptide Synthesis. I. The Synthesis of a Tetrapeptide. Journal of the American Chemical Society, 85(14), 2149–2154.
6. Albericio, F., & El-Faham, A. (2018). Choosing the Right Coupling Reagent for Peptides: A Twenty-Five-Year Journey. Organic Process Research & Development, 22(7), 760–772.
7. Isidro-Llobet, A., Just-Baringo, X., Ewenson, A., Álvarez, M., & Albericio, F. (2007). Fmoc-2-mercaptobenzothiazole, for the introduction of the Fmoc moiety free of side-reactions. Biopolymers, 88(5), 733–737.
8. Sanz-Nebot, V., Toro, I., Garcés, A., & Barbosa, J. (1999). Separation and identification of peptide mixtures in a synthesis crude of carbetocin by liquid chromatography/electrospray ionization mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry, 13(23), 2341–2347.
9. Sanz-Nebot, V., Benavente, F., Toro, I., & Barbosa, J. (2003). Liquid chromatography -mass spectrometry approach for the characterization and purification of crude synthetic peptide hormones. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 377(2), 306–315.
10. Verbeke, F., Wynendaele, E., Braet, S., D’Hondt, M., & De Spiegeleer, B. (2015). Quality evaluation of synthetic quorum sensing peptides used in R&D. Journal of Pharmaceutical Analysis, 5(3), 169–181.
11. Lai, M. C., & Topp, E. M. (1999). Solid‐state chemical stability of proteins and peptides. Journal of Pharmaceutical Sciences, 88(5), 489–500.
12. Cromwell, M. E. M., Hilario, E., & Jacobson, F. (2006). Protein aggregation and bioprocessing. The AAPS Journal, 8(3), E572–E579.
13. D’Hondt, M., Bracke, N., Taevernier, L., Gevaert, B., Verbeke, F., Wynendaele, E., & De Spiegeleer, B. (2014). Related impurities in peptide medicines. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 101, 2–30.
14. Cornish, J., Callon, K. E., Lin, C. Q.-X., Xiao, C. L., Mulvey, T. B., Cooper, G. J. S., & Reid, I. R. (1999). Trifluoroacetate, a contaminant in purified proteins, inhibits proliferation of osteoblasts and chondrocytes. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism, 277(5), E779–E783.
15. Gut, J., Christen, U., Frey, N., Koch, V., & Stoffler, D. (1995). Molecular mimicry in halothane hepatitis: Biochemical and structural characterization of lipoylated autoantigens. Toxicology, 97(1–3), 199–224.
16. Ma, T. G., Y. H. Ling, G. D. McClure, and M. T. Tseng. (1990). Effects oftrifluoroacetic acid, a halothane metabolite, on C6 glioma cells. J.Toxicol. Environ. Health 31: 147–158, 1990.
17. Collins, K. D., & Washabaugh, M. W. (1985). The Hofmeister effect and the behaviour of water at interfaces. Quarterly Reviews of Biophysics, 18(4), 323–422.
18. New stable pentadecapeptide salts, a process for preparation thereof, a use thereof in the manufacture of pharmaceutical preparations and a use thereof in therapy, US9850282B2
19. Stabilisation of peptides with basic amino acids, WO2007033427A1
20. Sibarov, D. A., Vol’nova, A. B., Frolov, D. S., & Nozdrachev, A. D. (2007). Effects of intranasal administration of epitalon on neuron activity in the rat neocortex. Neuroscience and Behavioral Physiology, 37(9), 889–893.

Zostaw odpowiedź

Your email address will not be published.Required fields are marked *